免疫熒光（IF）是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)。可用于檢測(cè)和識(shí)別細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)及其他分子的亞細(xì)胞分布和遷移。那么你知道免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)有什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、設(shè)置對(duì)照

可以使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照來(lái)確定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并幫助確定任何問題的來(lái)源。

二、樣品和試劑的存儲(chǔ)

由于IF中所用抗體和實(shí)驗(yàn)樣品的熒光性質(zhì)，因此必須適當(dāng)存儲(chǔ)。最好將熒光抗體和經(jīng)過IF處理的樣品都保存在wan全黑暗的環(huán)境中。使用琥珀色或鋁箔覆蓋抗體管。

三、使用適當(dāng)?shù)墓潭▌?/p>

醛可用于標(biāo)記膜結(jié)合抗原或細(xì)胞骨架抗原，并應(yīng)用于核蛋白或線粒體蛋白。醛固定后的樣本需要抗原修復(fù)和打孔滲透步驟才能正確檢測(cè)抗原。如果使用單克隆抗體推薦有機(jī)溶劑用于組織固定。甲醇適用于冷凍樣本的固定；丙酮固定對(duì)組織學(xué)保存效

四、仔細(xì)選擇抗體

應(yīng)檢查所有抗體，無(wú)論是單克隆抗體還是多克隆抗體，以確保與目標(biāo)抗原具有高的親和力。所用的二抗必須與一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗檢測(cè)小鼠來(lái)源的一抗。

五、多色染色

最好使用在不同物種中產(chǎn)生的一抗。如果使用間接檢測(cè)，請(qǐng)使用已預(yù)先吸附在檢測(cè)其他蛋白質(zhì)的一抗和二抗的種屬以及實(shí)驗(yàn)樣品的物種中的二抗。這樣可以zui大程度地減少跨物種的反應(yīng)性和非特異性結(jié)合。所有二抗也應(yīng)在同一物種中產(chǎn)生，以zui大程度地減少交叉反應(yīng)。

六、決定直接或間接染色

兩種方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇。使用這兩種方法，都應(yīng)該確保充足的洗滌以最小化非特異性的結(jié)合。

七、選擇沒有光譜重疊的熒光團(tuán)

IF是一種很好的多路復(fù)用分析技術(shù)，測(cè)量如此多的參數(shù)，那么使用能夠提供可分辨信號(hào)的熒光團(tuán)是很有必要的。

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